業績情報

• A multipoint guidance mechanism for β-barrel folding on the SAM complex　　　　　　　　　　　　　　　
  Hironori Takeda; Jon V. Busto; Caroline Lindau; Akihisa Tsutsumi; Kentaro Tomii; Kenichiro Imai; Yu Yamamori; Takatsugu Hirokawa; Chie Motono; Iniyan Ganesan; Lena-Sophie Wenz; Thomas Becker; Masahide Kikkawa; Nikolaus Pfanner; Nils Wiedemann; Toshiya Endo
  Nature Structural and Molecular Biology, 巻：30, 号：2, 開始ページ：176, 終了ページ：187, 2023年01月
  Springer Science and Business Media LLC, 研究論文（学術雑誌）
  DOI：https://doi.org/10.1038/s41594-022-00897-2
  DOI ID：10.1038/s41594-022-00897-2, ISSN：1545-9993, eISSN：1545-9985, Web of Science ID：WOS:000909509300001
• The structure of MgtE in the absence of magnesium provides new insights into channel gating
  Fei Jin; Minxuan Sun; Takashi Fujii; Yurika Yamada; Jin Wang; Andrés D. Maturana; Miki Wada; Shichen Su; Jinbiao Ma; Hironori Takeda; Tsukasa Kusakizako; Atsuhiro Tomita; Yoshiko Nakada-Nakura; Kehong Liu; Tomoko Uemura; Yayoi Nomura; Norimichi Nomura; Koichi Ito; Osamu Nureki; Keiichi Namba; So Iwata; Ye Yu; Motoyuki Hattori
  PLOS Biology, 巻：19, 号：4, 開始ページ：e3001231, 終了ページ：e3001231, 2021年04月
  MgtE is a Mg²⁺ channel conserved in organisms ranging from prokaryotes to eukaryotes, including humans, and plays an important role in Mg²⁺ homeostasis. The previously determined MgtE structures in the Mg²⁺-bound, closed-state, and structure-based functional analyses of MgtE revealed that the binding of Mg²⁺ ions to the MgtE cytoplasmic domain induces channel inactivation to maintain Mg²⁺ homeostasis. There are no structures of the transmembrane (TM) domain for MgtE in Mg²⁺-free conditions, and the pore-opening mechanism has thus remained unclear.
  
  Here, we determined the cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of the MgtE-Fab complex in the absence of Mg²⁺ ions. The Mg²⁺-free MgtE TM domain structure and its comparison with the Mg²⁺-bound, closed-state structure, together with functional analyses, showed the Mg²⁺-dependent pore opening of MgtE on the cytoplasmic side and revealed the kink motions of the TM2 and TM5 helices at the glycine residues, which are important for channel activity. Overall, our work provides structure-based mechanistic insights into the channel gating of MgtE.
  Public Library of Science (PLoS), 研究論文（学術雑誌）
  DOI：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001231
  DOI ID：10.1371/journal.pbio.3001231, eISSN：1545-7885
• Mitochondrial sorting and assembly machinery operates by β-barrel switching.　　　　　　　　　　　　　　　
  Hironori Takeda; Akihisa Tsutsumi; Tomohiro Nishizawa; Caroline Lindau; Jon V Busto; Lena-Sophie Wenz; Lars Ellenrieder; Kenichiro Imai; Sebastian P Straub; Waltraut Mossmann; Jian Qiu; Yu Yamamori; Kentaro Tomii; Junko Suzuki; Takeshi Murata; Satoshi Ogasawara; Osamu Nureki; Thomas Becker; Nikolaus Pfanner; Nils Wiedemann; Masahide Kikkawa; Toshiya Endo
  Nature, 巻：590, 号：7844, 開始ページ：163, 終了ページ：169, 2021年02月, ［国際誌］
  The mitochondrial outer membrane contains so-called β-barrel proteins, which allow communication between the cytosol and the mitochondrial interior1-3. Insertion of β-barrel proteins into the outer membrane is mediated by the multisubunit mitochondrial sorting and assembly machinery (SAM, also known as TOB)4-6. Here we use cryo-electron microscopy to determine the structures of two different forms of the yeast SAM complex at a resolution of 2.8-3.2 Å. The dimeric complex contains two copies of the β-barrel channel protein Sam50-Sam50a and Sam50b-with partially open lateral gates. The peripheral membrane proteins Sam35 and Sam37 cap the Sam50 channels from the cytosolic side, and are crucial for the structural and functional integrity of the dimeric complex. In the second complex, Sam50b is replaced by the β-barrel protein Mdm10. In cooperation with Sam50a, Sam37 recruits and traps Mdm10 by penetrating the interior of its laterally closed β-barrel from the cytosolic side. The substrate-loaded SAM complex contains one each of Sam50, Sam35 and Sam37, but neither Mdm10 nor a second Sam50, suggesting that Mdm10 and Sam50b function as placeholders for a β-barrel substrate released from Sam50a. Our proposed mechanism for dynamic switching of β-barrel subunits and substrate explains how entire precursor proteins can fold in association with the mitochondrial machinery for β-barrel assembly.
  英語, 研究論文（学術雑誌）
  DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-020-03113-7
  DOI ID：10.1038/s41586-020-03113-7, PubMed ID：33408415
• SAM複合体によるミトコンドリアβバレル膜タンパク質の膜組み込み
  竹田弘法; 遠藤斗志也
  生物物理, 巻：61, 号：6, 開始ページ：392, 終了ページ：394, 2021年, ［査読有り］, ［招待有り］
  Biophysical Society of Japan, 日本語, 研究論文（学術雑誌）
  DOI：https://doi.org/10.2142/biophys.61.392
  DOI ID：10.2142/biophys.61.392, ISSN：0582-4052, eISSN：1347-4219
• ATP-dependent modulation of MgtE in Mg2+ homeostasis
  Atsuhiro Tomita; Mingfeng Zhang; Fei Jin; Wenhui Zhuang; Hironori Takeda; Tatsuro Maruyama; Masanori Osawa; Ken-ichi Hashimoto; Hisashi Kawasaki; Koichi Ito; Naoshi Dohmae; Ryuichiro Ishitani; Ichio Shimada; Zhiqiang Yan; Motoyuki Hattori; Osamu Nureki
  Nature Communications, 巻：8, 号：1, 2017年07月
  Abstract
  
  Magnesium is an essential ion for numerous physiological processes. MgtE is a Mg²⁺ selective channel involved in the maintenance of intracellular Mg²⁺ homeostasis, whose gating is regulated by intracellular Mg²⁺ levels. Here, we report that ATP binds to MgtE, regulating its Mg²⁺-dependent gating. Crystal structures of MgtE–ATP complex show that ATP binds to the intracellular CBS domain of MgtE. Functional studies support that ATP binding to MgtE enhances the intracellular domain affinity for Mg²⁺ within physiological concentrations of this divalent cation, enabling MgtE to function as an in vivo Mg²⁺ sensor. ATP dissociation from MgtE upregulates Mg²⁺ influx at both high and low intracellular Mg²⁺ concentrations. Using site-directed mutagenesis and structure based-electrophysiological and biochemical analyses, we identify key residues and main structural changes involved in the process. This work provides the molecular basis of ATP-dependent modulation of MgtE in Mg²⁺ homeostasis.
  Springer Science and Business Media LLC, 研究論文（学術雑誌）
  DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-017-00082-w
  DOI ID：10.1038/s41467-017-00082-w, eISSN：2041-1723
• Structural basis for dynamic mechanism of nitrate/nitrite antiport by NarK.　　　　　　　　　　　　　　　
  Masahiro Fukuda; Hironori Takeda; Hideaki E Kato; Shintaro Doki; Koichi Ito; Andrés D Maturana; Ryuichiro Ishitani; Osamu Nureki
  Nature communications, 巻：6, 開始ページ：7097, 終了ページ：7097, 2015年05月, ［国際誌］
  NarK belongs to the nitrate/nitrite porter (NNP) family in the major facilitator superfamily (MFS) and plays a central role in nitrate uptake across the membrane in diverse organisms, including archaea, bacteria, fungi and plants. Although previous studies provided insight into the overall structure and the substrate recognition of NarK, its molecular mechanism, including the driving force for nitrate transport, remained elusive. Here we demonstrate that NarK is a nitrate/nitrite antiporter, using an in vitro reconstituted system. Furthermore, we present the high-resolution crystal structures of NarK from Escherichia coli in the nitrate-bound occluded, nitrate-bound inward-open and apo inward-open states. The integrated structural, functional and computational analyses reveal the nitrate/nitrite antiport mechanism of NarK, in which substrate recognition is coupled to the transport cycle by the concomitant movement of the transmembrane helices and the key tyrosine and arginine residues in the substrate-binding site.
  英語, 研究論文（学術雑誌）
  DOI：https://doi.org/10.1038/ncomms8097
  DOI ID：10.1038/ncomms8097, PubMed ID：25959928, PubMed Central ID：PMC4432589
• Structural basis for ion selectivity revealed by high-resolution crystal structure of Mg2+ channel MgtE.　　　　　　　　　　　　　　　
  Hironori Takeda; Motoyuki Hattori; Tomohiro Nishizawa; Keitaro Yamashita; Syed T A Shah; Martin Caffrey; Andrés D Maturana; Ryuichiro Ishitani; Osamu Nureki
  Nature communications, 巻：5, 開始ページ：5374, 終了ページ：5374, 2014年11月, ［国際誌］
  Magnesium is the most abundant divalent cation in living cells and is crucial to several biological processes. MgtE is a Mg(2+) channel distributed in all domains of life that contributes to the maintenance of cellular Mg(2+) homeostasis. Here we report the high-resolution crystal structures of the transmembrane domain of MgtE, bound to Mg(2+), Mn(2+) and Ca(2+). The high-resolution Mg(2+)-bound crystal structure clearly visualized the hydrated Mg(2+) ion within its selectivity filter. Based on those structures and biochemical analyses, we propose a cation selectivity mechanism for MgtE in which the geometry of the hydration shell of the fully hydrated Mg(2+) ion is recognized by the side-chain carboxylate groups in the selectivity filter. This is in contrast to the K(+)-selective filter of KcsA, which recognizes a dehydrated K(+) ion. Our results further revealed a cation-binding site on the periplasmic side, which regulate channel opening and prevents conduction of near-cognate cations.
  英語, 研究論文（学術雑誌）
  DOI：https://doi.org/10.1038/ncomms6374
  DOI ID：10.1038/ncomms6374, PubMed ID：25367295, PubMed Central ID：PMC4241985

• ミトコンドリア外膜における巨大チャネル形成の構造・機能研究　　　　　　　　　　　　　　　
  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 若手研究, 2022年04月 - 2025年03月
  竹田 弘法, 奈良先端科学技術大学院大学
  配分額（総額）：4550000, 配分額（直接経費）：3500000, 配分額（間接経費）：1050000
  課題番号：22K15078
• 中性子反射率法を中心とした多角的な解析によるグラム陰性菌の膜生合成解析　　　　　　　　　　　　　　　
  日本学術振興会, 科学研究費助成事業 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B)), 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B)), 2021年10月 - 2024年03月
  塩田 拓也; 田岡 東; 宮崎 亮次; 竹田 弘法, 宮崎大学
  配分額（総額）：18980000, 配分額（直接経費）：14600000, 配分額（間接経費）：4380000
  本研究では、生体高分子の高い時空間分解能での解析を実現する手法として、中性子反射率法を中心に、in vivoでの架橋法、クライオ電子顕微鏡による構造解析、高速AFM、そして単離膜を用いたin vitro再構築実験の5つの多角的な手法を駆使し、これらを組み合わせた統合的な解析法の確立を目指している。そのモデルケースとして、大腸菌のBAM複合体を中心とした外膜タンパク質輸送複合体および、磁性細菌のマグネトソーム形成タンパク質を用いる。初年度は、国際共同研究先の渡航制限が解除されず、オンラインでの共同研究にとどまったが、BAM複合体の中性子反射率実験で得られたデータ解析を共同で実施し、基質が結合した状態のBAM複合体の分子形態を決定することができた。また、in vitro再構築実験系では、輸送されるタンパク質が持っている新規シグナルを決定し、過渡的な中間体を形成する新規条件を確立した。また、架橋実験では、多様な因子による補助を必要とするLptDのアセンブリーに着目し、それぞれの因子がどのように相互作用しているかを高い空間分解能で決定した。さらにクライオ電子顕微鏡による構造解析では、輸送装置の精製に成功し、現在再構築実験で見出された中間体の構造解析を実現すべく変異基質の精製を進めている。また、高速AFMでは、マグネトソームの形成再現に必要な因子を同定するとともに、マグネトソーム小胞の精製法を検討した。さらに、細菌表層の高速AFMによるイメージングのための固定化技術の確立および、動的な物性変化を捉えることに成功している。
  課題番号：21KK0126
• X線結晶構造解析によるミトコンドリアトランスロケータSAM複合体の構造基盤　　　　　　　　　　　　　　　
  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 若手研究, 2018年04月 - 2022年03月
  竹田 弘法
  配分額（総額）：4290000, 配分額（直接経費）：3300000, 配分額（間接経費）：990000
  ミトコンドリアが正常に機能するには、ミトコンドリア外膜に局在する様々なβバレル膜タンパク質による物質輸送が不可欠である。これらのβバレル膜タンパク質を膜へ埋め込むのが、SAM複合体である。我々は、SAM複合体と、基質タンパク質を膜へ埋め込んだ直後のSAM-Mdm10超複合体のクライオ電顕構造を決定し、SAM複合体による基質交換メカニズムを解明した。本研究は Nature へ掲載された。また、SAM複合体が基質タンパク質を膜へ埋め込む途中のクライオ電顕構造を決定し、その分子メカニズムの一端を解明した。
  課題番号：18K14640
• ミトコンドリアトランスロケーターＳＡＭ複合体の構造・機能研究　　　　　　　　　　　　　　　
  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 特別研究員奨励費, 2018年04月 - 2021年03月
  竹田 弘法, 京都産業大学
  配分額（総額）：4030000, 配分額（直接経費）：3100000, 配分額（間接経費）：930000
  本研究では、βバレル膜タンパク質をミトコンドリア外膜へ挿入するSAM複合体タンパク質の精密構造を決定し、そのメカニズムの解明を目的としている。SAM複合体はβバレルタンパク質Sam50と可溶性タンパク質Sam35/Sam37によって構成される。しかし、SAM複合体がどのように形成されており、どのように基質タンパク質をβバレルに整形するのかは不明である。そこで我々は、SAM複合体のクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析と、構造に基づいたin vitro機能解析により、SAM複合体によるタンパク質整形メカニズムの解明に向けて取り組んできた。クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析では、SAM複合体の構造を分解能2.6オングストロームで決定することに成功した。SAM複合体のクライオ構造では、Sam50がダイマーを形成し、サイトゾル側からSam35/Sam37がSam50と結合していた。in vitro機能解析を行なった結果、基質βバレルタンパク質は、Sam37に結合したSam50と入れ替わるようにしてSam37と結合し、Sam35に結合したSam50が基質βバレルタンパク質を膜へ挿入することを明らかにした。以上の結果から、基質タンパク質がSAM複合体に結合すると、SAM複合体のSam50ダイマーのうち、Sam37と結合するSam50と入れ替わり、基質タンパク質の整形が進むという、βバレルスイッチモデルを提唱するに至った。これらの研究成果は、Natureに掲載された。当初、クライオ電子顕微鏡の使用を予定していたが、論文作成などにより不要となったため、未使用金が生じた。
  課題番号：18J00358
• X線結晶構造解析を基盤としたマグネシウムイオン輸送体MgtEの開構造の解明　　　　　　　　　　　　　　　
  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 特別研究員奨励費, 2013年 - 2014年
  竹田 弘法, 東京大学
  配分額（総額）：1800000, 配分額（直接経費）：1800000
  マグネシウムイオン(Mg2+)は細胞内で最も豊富な二価金属イオンであり、様々な生理的役割を担っている。Mg2+はゲノム情報の複製・転写・翻訳における補酵素であり、リボソーム・脂質二重膜・ゲノム・核酸の安定化に重要である。それゆえ細胞内におけるMg2+濃度の恒常性は生命活動に極めて重要であると言える。Mg2+チャネルであるMgtEはイオン透過孔に厳密に保存されたMg2+選択フィルターAsp432の側鎖カルボニル酸素原子により、水和状態にあるMg2+を認識することが、MgtEの結晶構造から提唱されていた。しかし、分解能が不十分なため、MgtEの詳細な二価金属イオンに対する認識メカニズムは未だ不明である。そこで申請者は、水和水を含めたMgtEの詳細なMg2+認識メカニズムを解明するため、MgtEの高分解能構造の決定に着手した。その結果、MgtEの結晶構造を分解能2.3Åで決定することに成功した。イオン透過孔に存在するMg2+は六水和状態をとり正八面体構造となっていた。さらに、Mg2+選択フィルターAsp432はMg2+に配意する水和水と水素結合を形成しており、この構造からMgtEはMg2+を水和状態で認識することが明らかとなった。Mg2+のみならず、申請者はCa2+やMn2+存在下においてもMgtEの結晶構造を明らかにし、特にMn2+結合型MgtEにおいては、Asp432だけでなく、イオン透過孔の細胞外側、そして膜貫通ドメインの細胞外側の計2カ所にMn2+結合部位が存在することを見出した。これらの結合部位を構成するアミノ酸を変異させたMgtEを調製し、リポソームを用いたMg2+輸送機能解析を行った結果、Mn2+結合部位はMn2+と結合することでMg2+輸送を阻害する働きを有することが明らかとなった。
  課題番号：13J07168