DNA鎖間架橋修復に関与するヌクレアーゼの遺伝学的解析
塚田耕太郎; 吉原亮平; 畠山晋; 田中秀逸
日本遺伝学会大会プログラム・予稿集, 巻：92nd, 2020年
J-Global ID：202002243003078261
複製ストレス応答におけるヒストンH3K4メチル化の重要性
柳澤健斗; 吉原亮平; 畠山晋; 田中秀逸
日本遺伝学会大会プログラム・予稿集, 巻：92nd, 2020年
J-Global ID：202002259315982936
アカパンカビにおけるDNA損傷に応答したアポトーシス機構活性化の可視化に関する研究
田中秀逸
総合研究機構研究プロジェクト研究成果報告書, 巻：第6号(平成19年度), 2008年
アカパンカビにおけるDNA損傷に応答したアポトーシス機構活性化の可視化に関する研究
田中秀逸
巻：第6号(平成19年度), 2008年
高速分子進化による高機能バイオ分子の創出 : 相同組換え機能を使っての遺伝子ターゲッティング法
井上弘一; 田中秀逸; 畠山晋
埼玉大学地域共同研究センター紀要, 巻：8, 開始ページ：24, 終了ページ：26, 2007年
アカパンカビにおけるDNA損傷応答に関する転写レベルのプロファイリング
田中秀逸
総合研究機構研究プロジェクト研究成果報告書, 巻：第5号(18年度), 開始ページ：209, 終了ページ：210, 2007年
高速分子進化による高機能バイオ分子の創出--相同組換え機能を使っての遺伝子ターゲッティング法
井上 弘一; 田中 秀逸; 畠山 晋
埼玉大学地域共同研究センター紀要, 巻：8, 号：8, 開始ページ：24, 終了ページ：26, 2007年
DNA double strand breaks are mainly repaired by homologous recombination (HR) and nonhomologous end joining (NHEJ). In this article, we describe gene targeting efficiency in HR mutants and NHEJ mutants of the filamentous fungus Neurospora crassa. And we conclude that NHEJ-defective mutant is a most ideal host for gene targeting.
埼玉大学総合研究機構地域共同研究センター産学連携推進部門, 日本語
ISSN：1347-4758, CiNii Articles ID：120001371294, CiNii Books ID：AA11808968
アカパンカビにおけるDNA損傷応答に関する転写レベルのプロファイリング
田中秀逸
巻：第5号(18年度), 開始ページ：209, 終了ページ：210, 2007年
非相同組換え修復欠損細胞における標的遺伝子特異的な遺伝子破壊法の開発
田中秀逸
総合研究機構研究プロジェクト研究成果報告書, 巻：第4号(17年度), 2006年
非相同組換え修復欠損細胞における標的遺伝子特異的な遺伝子破壊法の開発
田中秀逸
巻：第4号(17年度), 2006年
Selective inflammatory stimulations enhance release of microglial response factor (MRF)-1 from cultured microglia S Tanaka; T Koike
巻：40,
号：3,
開始ページ：360,
終了ページ：371, 2002年12月
The mrf-1 gene has been isolated from microglia exposed to cultured cerebellar granule neurons undergoing apoptosis. We have shown that mrf-1 is upregulated in response to neuronal death and degeneration both in vitro and in vivo. However, the exact role of MRF-1 remains unknown. Here we show that MRF-1 is released from cultured rat microglia, and its release is greatly enhanced under inflammatory conditions. When microglia were treated with ATP, the amount of MRF-1 that was released increased 10-fold compared to the basal level of release. Enhanced MRF-1 release was induced within 10 min and peaked within 1 h; after similar to 4 h, the MRF-1 release had returned to normal. MRF-1 release was stimulated by 2-methyl-thio-ATP (five-fold) and a P2X(7) selective agonist, 2'- and 3'-O-(4-benzoylbenzoyl)-ATP (ten-fold). Moreover, the ATP-stimulated MRF-1 release was inhibited by a P2X(7) selective antagonist, oxidized ATP (oATP), and also under a Ca2+-free condition. These results indicate that the effects of ATP are dependent on Ca2+ influx through P2X(7) receptors. MRF-1 release was enhanced by Ca2+-ionophore A23187 (sixfold), thapsigargin (threefold); however, it was not enhanced by glutamate or lipopolysaccharide. Moreover, a platelet-activating factor enhanced microglial MRF-1 release in a dose-dependent manner. We also showed that a conditioned medium from cerebellar granule neurons undergoing apoptosis markedly increased MRF-1 release from microglia; that effect was significantly inhibited by oATP. These results indicate that selective inflammatory stimulations, including ATP and PAF, enhance MRF-1 release from microglia through a Ca2+-dependent mechanism and suggest that MRF-1 may play a role in cell-cell interactions under inflammatory conditions. (C) 2002 Wiley-Liss, Inc.
英語
DOI：https://doi.org/10.1002/glia.10142DOI ID：10.1002/glia.10142,
ISSN：0894-1491,
eISSN：1098-1136,
Web of Science ID：WOS:000179539700008 Activation of protein kinase C delays apoptosis of nerve growth factor-deprived rat sympathetic neurons through a Ca2+-influx dependent mechanism S Tanaka; T Koike
巻：313,
号：1-2,
開始ページ：9,
終了ページ：12, 2001年11月
The effects of protein kinase C (PKC) activation on apoptosis depend on the cell type and on the isoenzymes activated. We show that the apoptosis of nerve growth factor (NGF)-deprived rat sympathetic neurons is delayed for about 24 h by treatment with O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA). The cell death was estimated by both morphological changes and the release of a cytoplasmic enzyme into the medium. The PKC inhibitor bisindolylmaleimide inhibited the TPA-mediated delay of neuronal death. The effect of TPA was abolished in conditions of Ca2+-free or in the presence of both Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors, but was not blocked by either an L- or N-type Ca2+ channel inhibitor. These results suggest that the survival of the NGF-deprived neurons may be supported by PKC activation followed by Ca2+ influx. (C) 2001 Elsevier Science Ireland Ltd. All rights reserved.
英語
DOI：https://doi.org/10.1016/S0304-3940(01)02193-0DOI ID：10.1016/S0304-3940(01)02193-0,
ISSN：0304-3940,
Web of Science ID：WOS:000172059000003 Microglial response factor (MRF)-1: Constitutive expression in ramified microglia and upregulation upon neuronal death induced by ischemia or glutamate exposure S Tanaka; H Kato; T Koike
巻：17,
号：5,
開始ページ：571,
終了ページ：578, 2000年07月
We have isolated a new microglial gene, mrf-1,which is upregulated on microglia in response to apoptosis of granule neurons in cerebellar cell cultures. We examined whether or not upregulation of MRF-1 is observed in response to necrotic neuronal death both in vivo and in vitro. Though MRF-1 was detected on ramified/resting microglia in the brain of normal adult rats, activated microglia in the region of the brain where neuronal damage was induced by ischemia were strongly immunostained with anti-MRF-1 antibody, In the in vitro system, we confirmed, with immunocytochemistry or RT-PCR, that MRF-1 or mrf-1 mRNA were constitutively expressed in ramified microglia at significant but lower levels than in amoeboid one. Moreover, by Northern blot, it was ascertained that expression level of mrf-1 mRNA on microglia was markedly upregulated in response to glutamate-induced death of granule cells in a cerebellar cell culture. These results indicate the following: 1) expression of mrf-1 in microglia may be markedly enhanced upon not only apoptotic but also necrotic neuronal death, and 2) MRF-1 is, thus, an useful marker for identifying all types of microglia in vivo and in vitro.
英語
DOI：https://doi.org/10.2108/zsj.17.571DOI ID：10.2108/zsj.17.571,
ISSN：0289-0003,
CiNii Articles ID：110003371170,
PubMed ID：8940912,
Web of Science ID：WOS:000088872800002 Upregulation of a new microglial gene, mrf-1, in response to programmed neuronal cell death and degeneration
S Tanaka; K Suzuki; M Watanabe; A Matsuda; S Tone; T Koike
巻：18, 号：16, 開始ページ：6358, 終了ページ：6369, 1998年08月
Cerebellar granule neurons isolated from postnatal day 7 (P7) rats and grown in normal K(+)medium begin to degenerate at approximately 4 d in vitro (DIV) and die. To search for genes upregulated in the process of neuronal cell death, differential hybridization was performed with subtracted cDNA probes and a cDNA library from 5 DIV. One of the genes isolated was microglial response factor-1 (mrf-1), which encoded a sequence of 177 amino acids with a single EF-hand calcium-binding motif. By Northern blots, the transcript was upregulated in cerebellar culture at 4 DIV, peaked at 6 DIV, and decreased at 7 DIV. Upregulation was also found when the apoptosis of granule cells was induced by replacing high K+ medium with normal K+ medium. However, when non-neuronal cells were thoroughly eliminated with aphidicolin, an antimitotic agent, the upregulation at 4-7 DIV did not occur. By immunocytochemistry, MRF-I was detected at 5 DIV in OX-42-positive cells (microglia), and it exhibited an increase in response to granule cell death. MRF-1 levels in microglia purified from cerebral cortex also upregulated in the presence of 5 DIV granule cells. In the developing cerebellum in vivo, levels of mrf-1 mRNA transiently increased in the early postnatal stages, reaching a peak at P7 when cerebellar neurons and astrocytes undergo extensive apoptosis. In adult brain sections, MRF-1 was detected in the perikarya and processes of ramified/resting microglia, and peripheral motor nerve dissection prominently increased the expression in activated microglia surrounding injured central motoneurons. Therefore, mrf-1 appears to be one of the microglial genes that respond to neuronal cell death and degeneration.
英語
ISSN：0270-6474, Web of Science ID：WOS:000075246500028
Veratridine delays apoptotic neuronal death induced by NGF deprivation through a Na+-dependent mechanism in cultured rat sympathetic neurons S. Tanaka; T. Koike
巻：15,
号：1,
開始ページ：15,
終了ページ：27, 1997年07月31日
Superior-cervical ganglion (SCG) cells dissociated from newborn rats depend on nerve growth factor (NGF) for survival. Membrane depolarization with elevated K+ is known to prevent neuronal death following NGF deprivation and/or to promote survival via a Ca2+-dependent mechanism. Here we have exploited the possibility of whether or not a Na+-dependent pathway for neuronal survival is present in these cells. Veratridine (EC50 = 40 nM), a voltage-dependent Na+ channel activator, significantly delayed the onset of apoptotic cell death in NGF-deprived SCG neurons that had been cultured for 7 days in the presence of NGF. This effect was blocked completely by Na+ channel blockers including tetrodotoxin (TTX, 1 μM), benzamil (25 μM) and flunarizine (1 μM), but was not attenuated by nimodipine (1 μM), an L-type Ca2+ channel blocker. The saving effect of veratridine on cultured neurons was observed even in low Ca2+ media (0-1.0 mM), but was completely abolished in a low Na+ medium (38 mM). Sodium-binding benzofuran isophthalate was employed as a fluorescent probe for monitoring the level of cytoplasmic free Na+, which revealed a sustained increase in its level (12.9 mM, 307% of that of control) in response to veratridine (0.75 μM). The TTX or flunarizine completely blocked veratridine-induced Na+ influx in these cultured neurons. Moreover, no appreciable increase in intracellular Ca2+ was detected under these conditions. Though Na+ channels were effectual in SCG neurons which were freshly isolated from newborn rats, the Na+-dependent saving effect of veratridine was not observed in these young neurons. These lines of evidence suggest that the death-suppressing effect of veratridine on cultured SCG neurons depends on the Na+ influx via voltage-dependent Na+ channels, and suggests the presence of Na+-dependent regulatory mechanism(s) in neuronal survival.
英語
DOI：https://doi.org/10.1016/S0736-5748(96)00082-2DOI ID：10.1016/S0736-5748(96)00082-2,
ISSN：0736-5748,
PubMed ID：9099612,
SCOPUS ID：0030887258 Veratridine delays apoptotic neuronal death induced by NGF deprivation through a Na+ dependent mechanism in cultured rat sympathetic neurons. TANAKA S; KOIKE T
巻：15,
号：1,
開始ページ：15,
終了ページ：27, 1996年
DOI：https://doi.org/10.1016/S0736-5748(96)00082-2DOI ID：10.1016/S0736-5748(96)00082-2,
ISSN：0736-5748,
PubMed ID：9099612 UP-REGULATION OF L-TYPE CA2+ CHANNEL ASSOCIATED WITH THE DEVELOPMENT OF ELEVATED K+-MEDIATED SURVIVAL OF SUPERIOR CERVICAL-GANGLION CELLS IN-VITRO S TANAKA; T KOIKE
巻：168,
号：1,
開始ページ：166,
終了ページ：178, 1995年03月
We have previously shown that elevated K+-mediated neuronal survival correlates well with a sustained increase in cytoplasmic Ca2+ ([Ca2+](i)) through the opening of L-type Ca2+ channels. Elevated K+ (40 mM), however, failed to support the survival of superior cervical ganglion (SCG) cells freshly isolated from newborn rats, while another depolarizing agent, veratridine, was able to do so, suggesting that elevated K+-mediated Ca2+ influx occurs in a stage-dependent manner. Indeed, sustained levels of [Ca2+](i) in response to high K+ remained low (91 nM) in these neurons, but became elevated (238 nM) in SCG neurons which had been exposed to nerve growth factor (NGF) for 5-7 days and were capable of responding to elevated K+ by survival. Semiquantitative PCR measurements of L-type Ca2+ channel mRNA revealed that this transcript increased dramatically during incubation with NGF for 3 days and reached a plateau level at Day 5 (seven-fold per surface area or nine-fold per total volume compared to that at Day 1). These findings show that NGF-mediated up-regulation of the expression of L-type Ca2+ channel mRNA correlates with the development of elevated K+-mediated neuronal survival in vitro and suggest its involvement in coordinate strengthening of pre- and postganglionic synapses in rat SCG neurons. (C) 1995 Academic Press,Inc.
英語
DOI：https://doi.org/10.1006/dbio.1995.1069DOI ID：10.1006/dbio.1995.1069,
ISSN：0012-1606,
CiNii Articles ID：30018554932,
PubMed ID：7883071,
Web of Science ID：WOS:A1995QK99100014 PROGRAMMED NEURONAL CELL-DEATH IN PC12 CELLS PRIMED WITH NERVE GROWTH-FACTOR
T KOIKE; S TANAKA
開始ページ：150, 終了ページ：150, 1993年03月
英語, 研究発表ペーパー・要旨（国際会議）
ISSN：0730-2312, Web of Science ID：WOS:A1993KV88000518
植物における遺伝子機能研究への標的領域特異的な高効率遺伝子改変技術の導入
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(C), 2012年04月01日 - 2015年03月31日
田中 秀逸, 埼玉大学
配分額（総額）：5590000, 配分額（直接経費）：4300000, 配分額（間接経費）：1290000
本課題の目的は、我々が開発した非相同末端結合能欠損株を用いた植物細胞における高効率遺伝子ターゲッティング法に関して、遺伝子機能解析や育種への応用への有効性を示すことであった。
特定の蛋白質へのタグ付けを行うための遺伝子導入用コンストラクトを作製したが、耐性を獲得したカルスは得られていない。RNAiによりKU70量を抑制した野生型細胞の作製を試みたが、形質転換カルスが得られないでいる。得られ次第ターゲッティング実験を行う。T-DNAによる高効率な細胞内への遺伝子導入法との共用の検討はできなかった。本研究で使用したカルスは、培地の植物ホルモン組成を変えることでシュート形成することを確認した。
課題番号：24570004
非相同末端結合能破壊株を用いた高効率な遺伝子組換え作物作製技術の新規基盤開発
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 挑戦的萌芽研究, 2009年 - 2010年
田中 秀逸; 井上 弘, 埼玉大学
配分額（総額）：3200000, 配分額（直接経費）：3200000
本研究は、当研究室においてアカパンカビで見いだした高効率の遺伝子ターゲッティング法の植物における有効性をモデル植物であるシロイヌナズナのカルス細胞で明らかにすることにあった。
昨年度、非相同末端結合に関わるAtLIG4遺伝子の破壊株において、標的遺伝子であるAG遺伝子にターゲットされたカルスが得られ、アカパンカビで見いだされた手法が植物にも有効であることが示唆され、それが論文に掲載された。
本年度は、宿主として、AtKU70およびAtKU80遺伝子の破壊株について実験を試みた。KU70遺伝子にT-DNAが導入された系統から得られた種子を藩種し破壊株を得ようとしたが、残念ながら破壊株は得られなかった。この系統を用いてAG遺伝子のターゲッティングを行ったところ、多数の選択遺伝子陽性カルスが得られたもののそれらの中にターゲットされたカルスは見つけられなかった。間接的ではあるが、AtLIG4破壊株での実験が正しいことが示唆されたと言える。KU80については破壊株が得られたので、同じ系統から得られた非破壊株および野生株を使い、AG遺伝子の破壊用コンストラクトの導入を行った。現在選択培地上での選択を継続している。今後、引き続き、他の遺伝子として準備したKU70遺伝子破壊実験、およびKU70遺伝子のRNAiを行った場合の効果について解析を進める。
課題番号：21658003
早期に細胞死をもたらす突然変異のミトコンドリアDNA欠失生成のメカニズム
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(C), 2008年 - 2010年
井上 弘一; 田中 秀逸; 畠山 晋, 埼玉大学
配分額（総額）：4810000, 配分額（直接経費）：3700000, 配分額（間接経費）：1110000
アカパンカビmus-10変異株はDNAのアルキル化剤であるMMSに対する高感受性株として単離された。変異原に高感受性を示すことからmus-10はDNA修復に関わることが予想されたが、その詳細は明らかではない。解析を進める中でこの株は数回の植継ぎで成長を停止し、それに伴ってミトコンドリアDNAに欠失が生じることが分かった。また、ミトコンドリア形態は野生株が管状であるのに対しmus-10変異株では粒状であった。原因遺伝子はF-box ドメインをもつタンパク質をコードしており、MUS-10タンパク質の機能にF-boxドメインは必須であることからユビキチン/プロテアソーム系を介したタンパク質分解経路で働くことが示唆された(Kato et al. 2010)。
MUS-10の機能をさらに解析するため、ミトコンドリア形態に注目し研究を行った。mus-10変異株ではミトコンドリアが断片化していたため、ミトコンドリアの融合がうまくいかない、もしくは、分裂が亢進していることが考えられる。ミトコンドリアの分裂に必須な遺伝子であるfis-1とmus-10の二重欠損株を作製した結果、二重欠損株ではミトコンドリア形態が野生株と似た形状を示しただけでなく、変異原高感受性や生育の早期停止もみられなくなった。このことはMUS-10タンパク質がミトコンドリア形態の維持に機能することにより、変異原高感受性や短寿命を防いでいることを示唆する。MUS-10はタンパク質分解経路で働き、分解される標的タンパク質と結合することが予想される。そのため、MUS-10と既知のミトコンドリア形態制御因子との結合をみた結果、ミトコンドリアの融合に関わるFZO-1と結合することが明らかとなった。FZO-1がMUS-10の分解の標的となっているかを調べるため、二重欠損株の作製を試みたが、fzo-1欠損株を作製することが出来ず、fzo-1は生育に必須である可能性が高い。また、mus-10変異株においてFZO-1を構成的に発現させることを試みた。
MUS-10がFZO-1の分解に働くのであれば、mus-10変異株ではFZO-1が蓄積しており、構成的に発現させることにより表現型の悪化がみられることが予想される。しかし、構成的なFZO-1の発現によりmus-10のミトコンドリア形態の異常、変異原高感受性、生育の早期停止がみられなくなった。以上より、MUS-10のミトコンドリア形態維持機構にはより複雑な仕組みがあることが示唆される。
課題番号：20570001
ミトコンドリアゲノムの安定性維持機構
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 特別研究員奨励費, 2008年 - 2010年
田中 秀逸; 井上 弘一; CHAE Michael; SUKYONG CHAE Michael; MICHAEL Sukyong Chae, 埼玉大学
配分額（総額）：2000000, 配分額（直接経費）：2000000
野生型のアカパンカビは栄養のある培地に植継つげば1年以上生育を続ける。にもかかわらず、数週間で生育が止まる突然変異株が見つかっている。その一つがmus-10変異株である。この株は、変異原に感受性を示す(mutagen sensitive)ことからその名がつけられ、さらに原因遺伝子が特定されていた。
本研究の実績の1つはこのコード蛋白質MUS-10タンパク質の局在に関するものである。MUS-10は細胞質に構成的に存在したが、ミトコンドリアフラクションからは検出されなかった。MUS-10はミトコンドリアで働く何らかのタンパク質に対しその移行途中において分解に関わり、その量の調節を行うのかもしれない。基質タンパク質の同定には至っていない。MUS-10タンパク質とその予想ヒトホモログとの間の保存された配列は、アカパンカビにおけるMUS-10の機能に重要であることが示された。ヒトホモログの発現の有無やその機能、何らかのミトコンドリア病に関わるのか興味が持たれる。次にミトコンドリア形態との関連を明らかにした。mus-10株の寿命や変異原感受性には確かにミトコンドリア形態が関連することが示された。mus-10株は培養初期からミトコン形態異常、変異原感受性を示し、その後培養に伴いミトコンドリアゲノムの欠失が起こる。以前、ミトコンドリアゲノム欠失に至る仕組みは不明である。
これらの結果の一部は以下の様にすでに公表した。残りについても、さらに実験を追加し発表の予定である。
課題番号：08F08756
効率的遺伝子ターゲッティングのための糸状菌における宿主の開発
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(B), 2006年 - 2007年
井上 弘一; 田中 秀逸; 畠山 晋; 五味 勝也; 阿部 啓悦, 埼玉大学
配分額（総額）：9420000, 配分額（直接経費）：8400000, 配分額（間接経費）：1020000
多くの生物でゲノム解読が進み、コンピューターによる遺伝子のアノテーションが行なわれているが、遺伝子の機能を知るには知りたい遺伝子を破壊して突然変異株を得ることが最も確実な方法である。そこで、多くの生物では本来生物が持っている相同組換え機構を利用し、細胞外から破壊したい遺伝子と相同部分を持つDNAを導入し、相同部分での組み換えにより遺伝子を破壊する方法が試みられてきた。しかしながら、多くの場合DNAは相同部分以外にランダムにゲノムに挿入されてしまう。我々は、ランダムに組み込まれる際に必要なタンパク質を作っている遺伝子(KU70およびKU80)を破壊することで100%相同部分に組み込むことに成功した。本研究では(1)KU以外の非相同組換えに関わる遺伝子を破壊し、ターゲット効率を更に上げること、(2)アカパンカビでこれまで試みてきた方法が他の糸状菌で同じ様に使えるかどうかの2点にしぼって研究を行った。その結果(1)KU以外でヒトのLig4ホモログ遺伝子やXRCC4ホモログ遺伝子を破壊しても高い率でターゲットができることを確認した。また(2)コウジ菌でもアカパンカビと同様に、LigD破壊株で効率のターゲットができることがあきらかになった。これからはこの方法を使用し自由に細胞内の遺伝子の改変ができるため、これらの結果の意味するところは極めて大きい。キノコについても同じ様に実験が行なわれたが、予想のできなかった困難のため、さらにここしばらくの実験が必要である。しかしながら基本的にはこの方法が有効であると思われるため引き続き実験を行なって行く予定である。現在、アカパンカビおよびコウジカビではこの方法をもとにしたシステマティックな遺伝子破壊が行なわれている。
課題番号：18370001
神経突起変性により誘導されるカスケードとその神経変性疾患モデルにおける解析
文部科学省, 科学研究費補助金(特定領域研究(C)), 特定領域研究(C), 2001年 - 2001年
小池 達郎; 田中 秀逸; 二宮 孝文; 刀祢 重信, 北海道大学
配分額（総額）：5400000, 配分額（直接経費）：5400000
神経突起変性と細胞体変性の独立性を調べる為にWallerian degeneration抵抗性マウス、コルヒチンによる輸送障害モデル、神経突起に起こる変性過程という3つの系を利用しその解明を試みている。Wallerian degeneration抵抗性マウスを用いた培養神経細胞実験から神経成長因子の除去及びコルヒチン処理により細胞体は野生型マウス由来の神経細胞のように細胞死を起こすが、これに反して神経突起は変性に耐性であった。現在神経突起におけるカスケードの同定を試みている。神経細胞体の変性は輸送障害モデルではアポトーシス過程と共に、空胞化によるネクローシス過程を見出し,後者がTLCKにより抑制されることを見出した。更にDifferential Display法を用いて、発現量の増加する遺伝子の探索し、5つの既知、3つのESTのサブクローンを得た。一例として、Vitamin D3 Up-Regulated Protein 1(VDUP1)は細胞死過程の早期に発現増加した。VDUP1は、レドックス、転写制御を行うThioredoxinと結合し、その働きを抑制することから、アポトーシスへの関与が示唆された。VDUP1 mRNAの発現はL型電位依存性Ca^<2+>チャネルのアンタゴニストであるNimodipine, Nifedipineにより誘導された。VDUP1 mRNAの発現はCa^<2+>によるシグナルにより制御していることが示唆された。
競争的資金, 課題番号：13210002
神経突起変性により誘発される細胞内カスケードの解明
文部科学省, 科学研究費補助金(特定領域研究(C)), 特定領域研究(C), 2000年 - 2000年
小池 達郎; 田中 秀逸; 二宮 孝文; 刀祢 重信, 北海道大学
(1)コルヒチンにより誘導される神経突起傷害におけるTLCK感受性セリンプロテアーゼの関与神経突起の変性を誘発するコルヒチンで神経細胞を処理するとカスパーゼ-3は活性化するものの、カスパーゼの一般的阻害剤(z-VAD)は細胞死を完全には抑制しなかった。これに対して、TLCKはDNAの断片化を抑制し、細胞死を顕著に抑制した。この結果はTLCK感受性セリンプロテアーゼがカスパーゼ依存及び非依存経路に関与することを示唆している。(2)神経細胞死における初期応答遺伝子の同定と解析小脳顆粒細胞は脱分極下(30mMK^+)で生存促進され、通常のK^+濃度(5.4mM K^+)に戻すとアポトーシスを起こす。このアポトーシスに伴い発現増加する遺伝子をDifferential Display法により探索した。その中で、VitaminD3 Up-Regulated Protein 1(VDUP1)は、最も顕著な発現増加を示した。VDUP1は、レドックス、転写制御を行うThioredoxinと結合しその働きを抑制することから、アポトーシスへの関与が示唆された。VDUP1 mRNAの発現がK^+濃度の減少後2時間で誘導されることから、L型電位依存性Ca^<2+>チャネルを介したCa^<2+>流入の効果について解析した。VDUP1 mRNAの発現はこのチャネルのアンタゴニストであるNimodipine,Nifedipineにより誘導され、タンパク質合成阻害剤の影響を受けなかった。またK^+濃度変化に応答して繰り返し誘導することが可能なことから、Ca^<2+>によるシグナルが直接的に発現を制御している可能性が示唆された。
競争的資金, 課題番号：12210023
BDNFは小脳外顆粒層由来顆粒細胞のアポトーシスを誘導するか?
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 萌芽的研究, 1998年 - 1999年
小池 達郎; 田中 秀逸, 北海道大学
配分額（総額）：2100000, 配分額（直接経費）：2100000
発生過程において小脳顆粒細胞は、外顆粒層で増殖分化し、グリア細胞を介して移動、内顆粒層にたどり着きシナプス結合を行うと考えられ、それぞれの層でアポトーシスを行うことが知られている。生後一週間のラット小脳全体より単離した小脳顆粒細胞を通常のK+濃度(5.4mM)下で培養すると、細胞は突起伸長・細胞肥大等の分化の後、変性を始め、死滅する。この細胞死は脱分極剤、BDNFなどにより抑制され、アポトーシスの特徴をもつことが明らかになった)。この過程で起こる遺伝子発現をノーザンブロット法により調べると、c-junは細胞死に伴い弱く誘導された。これに対して。cyclin D1(3.7kbp)は顕著に誘導された。抗cyclin D1抗体によるウェスタンブロットによっても増加が確認された。免疫組織化学では顆粒細胞の核のみならず、細胞死に先行して細胞質も染色されることが見出された。更に、この細胞死はミノシンなどの細胞周期阻害剤によって抑制された。この未熟な顆粒細胞で見出された。cyclin D1の顕著な誘導は成熟した顆粒細胞では起こらなかった。この結果はin vivoにおけると免疫組織化学的実験と符合すると考えられる。更に、外顆粒層のみを単離培養して、神経栄養因子などの効果を調べた。その結果、小脳全体を分散培養した場合と異なって、BDNFは細胞死を抑制しなかった。このため、BDNFの作用に関して、分化した顆粒細胞に対してはBDNFは細胞生存を促進するが、細胞増殖系の神経前駆細胞に対しては異なる作用を持つと考えられた。
課題番号：10878145
神経細胞死に応答して活性化する新規ミクログリア由来遺伝子の同定
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(B), 1997年 - 1999年
小池 達郎; 田中 秀逸; 渡辺 雅彦, 北海道大学
配分額（総額）：13400000, 配分額（直接経費）：13400000
生後1週間のラット小脳より単離した小脳顆粒細胞は2-4DIVで突起伸長・分化し、5-6DIVには約半数が死滅する。この過程はアポトーシスである。小脳顆粒細胞とグリア細胞の共培養系を作製することにより、神経細胞死に伴い発現が変化するグリア細胞の応答遺伝子を探索できる。3DIVの培養細胞をコントロールとし、5DIVで顕著に発現する遺伝子をdifferential hybridization法により検索した結果、細胞死に伴って活性化する6遺伝子が認められた。その1つをmrf-1と命名した。前年度に続いてmrf-1遺伝子の機能を解析するため、蛋白質レベルでの発現調節機構を調べた。その結果、ミクログリアが脳内の環境を敏感に認識し、脳が正常に向かうときはMRF-1の発現レベルは減少し、損傷を受けたときはその発現レベルは上昇した。ここで、MRF-1の発現調節機構として、発現減少機構ではATP刺激による細胞内Ca^<2+>流入の関与を、又、発現上昇機構ではグルタミン酸刺激によるcAMPの関与を考えた。次に、発現上昇する遺伝子(gcd-10)の配列を決定した。この遺伝子はマウス造血細胞由来のLAPTm5/E3と高い相同性を示した。これはリソゾームに局在する膜蛋白質であり、このため、培養ミクログリアや過剰発現系細胞を用いて免疫組織化学を行ったところ、細胞死に応答して発現上昇するリソゾーム遺伝子と判明した。細胞死に応答してリソゾームの機能亢進が起こると推定されるが、リソゾームにおける機能も不明であり、その機能解明が待たれる。
課題番号：09480217
神経細胞のアポトーシス抑制へのNF-KBカスケードの関与
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奨励研究(A), 1997年 - 1998年
田中 秀逸, 北海道大学
配分額（総額）：2000000, 配分額（直接経費）：2000000
(1) 小脳granule細胞の生存/細胞死抑制におK2おけるNF一kB経路の活性化の有無
N-tosyl-L-phenylalanine chloromety ketone(TPCK)によりNF-kBの活性を選択的に阻害したときの、高カリウム培地での小脳granule細胞の生存/細胞死を調べた。いくつかの濃度(1〜10uM)についてTPCKの影響を調べたが、明かな効果は認められなかった。しかしながら、最近、TPCKがアポトーシスの実行酵素であるカスペースの活性も阻害することが報告された。TPCKがカスペースを阻害したため、結果的に細胞の生存が維持された可能性もでてきた。神経細胞の生存/細胞死抑制におけるNF-kB経路の活性化の有無についての判断には、ゲルシフト法による実際のNF-kB siteの活性状態のアッセイや別の阻害剤を用いた実験、NF-kBの強制的な活性化等も行い、更に検討を重ねる必要がある。
(2) 神経細胞死に応答して発現が増加するミクログリア遺伝子mrf-1の機能解析
in vivoでの神経損傷に応答したミクログリアでのmrf-1/MRF-1の発現増加を明らかにする一方で、ラット小脳細胞の培養系及び単離したミクログリアを用いてのmrf-1発現とミクログリアの活性化状態、増殖、捕食等との関連調べた。aphidicolinを用いてミクログリアの増殖を完全に抑制した場合にも、小脳細胞培養系での顆粒神経細胞の細胞死に応答したmrf-1mRNAの増加が、ノーザンプロットにより確かめられた。蛍光標識したイーストの粒子であるZymosanAを捕食させてもmrf-1/MRF-1の増加は起こらなかった(これらの結果はJ.Neurosci.に掲載された)。またmrf-1発現レベルはramified/resting microguliaよりも、moeboid/activate microgliaでより高いこと、MRF-1がミクログリアの新しいマーカーとしても有効なことを明かにした(論文投稿中)。単離ミクログリアでのmrf-1発現は、IFrによる処理でわずかに高まるものの、ミクログリアの活性化剤として知られるLPSではむしろ減少した。NO産生能を指標にいくつかの薬剤処理によるミクログリアの活性状態の変化を調べ、その時のmrf-1発現レベルを解析したが、それらの間に相関は見られなかった。現在のところMRF-1の機能の特定には至っていないが、近年指摘されている脳疾患・障害下におけるミクログリア機能の重要性からも、引き続きこの研究を進める必要がある。
課題番号：09780715
小胞体ストレスによるニューロン死制御
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 重点領域研究, 1997年 - 1997年
小池 達郎; 田中 秀逸, 北海道大学
配分額（総額）：1500000, 配分額（直接経費）：1500000
熱ショック蛋白質HPS70ファミリーのうちBiP/GRP78は小胞体のみに存在し、タンパク質の膜透過、立体構造の安定化に必要な分子シャペロンである。種々の小胞体ストレスによって生体を防御的に導く可能性が考えられる。我々はこの遺伝子がPC12細胞のNGF除去による細胞死において特異的に活性化することを見出した。この事実を利用して、BiP/GRP78の役割の解明や遺伝子導入による改変によって、この遺伝子の活性化が起こらないプログラム神経細胞死を制御することができるのではないかと考えた。現在、遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込んで、交感神経節細胞に安定に発現することができた。BiP/GRP78遺伝子を導入すると細胞内カルシウムストアの容量は著しく増大した。現在、細胞死に関する効果を調べている。さらに、ブレフェルジンなどの種々の小胞体ストレスが神経細胞死を誘発することを見いだした。サプシガ-ギンはこれに対し抑制効果を持っている。この薬剤は、Ga2+-ATPaseの阻害剤で、これによるカルシウムの減少は、小胞体にストレスとして働きBiP/GRP78の活性化を導くことも判った。このブレフェルジンによる細胞死は用量依存的にタンパク生合成の阻害剤で抑制されなど積極的な細胞死であった。ヘキスト染色やTUNELによりアポトーシスであることがわかった。サプシガ-ギンによる抑制効果は完全ではなく、チロシンキナーゼ阻害剤であるハービマイシンとの組み合わせで完全に細胞死は抑制された。このことから、BiP/GRP78と共同で働くこの因子を同定することが今後の課題である。
課題番号：09280202
神経細胞のアポトーシス初期過程で活性化する遺伝子の探索
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奨励研究(A), 1996年 - 1996年
田中 秀逸, 北海道大学
配分額（総額）：1100000, 配分額（直接経費）：1100000
1)生後1〜2日のラットから単離し、培養7日後の上頚神経節(SCG)細胞を用いてNGF除去後の神経細胞死(アポトーシス)の初期に発現の変化する遺伝子を探索した。NGF除去により細胞死を誘発したSCG細胞から、6時間後RNAを単離し、mRNAをRAP-PCR法を用いて調べ、対照(4時間NGF非存在下に置いた後2時間40mMカリウムで脱分極処理し細胞死を抑制したもの)と比較したところ、25本のバンドに変化が見られた。それらのクローニングにより得られた約50個のプラスミドについて、リバースノーザン法を行った結果、細胞死抑制で発現の減少する3種のクローンと発現の増加する3種のクローンについて再現性が確かめられた。うち4本に付いてシークエンシング、ホモロジー検索を行ったが、3本は未知であることがわかった。ノーザンブロット法を用いて発現変化の確認を進めている。2)ベラトリジンはNa_+チャンネルの活性化剤で、細胞内へのNa_+またはCa2_+の流入、すなわち細胞の脱分極を誘導する。ベラトリジンによる脱分極の神経細胞生存/細胞死への効果を検討した。生後1〜2日のラットから単離し、培養7日後のSCG細胞では、1μM以上の濃度で用いるとNa_+,Ca2_+両イオンの流入をもたらすが、それより低い濃度ではNa_+に対し特異的に対し特異的に作用することがわかった。更に、このSCG細胞のNGF除去に伴う細胞死について調べたところ、低濃度のベラトリジン(0.25^〜0.75μM)は細胞死の進行を遅らせることがわかった。この細胞死遅延効果は明らかに細胞外のNa_+に依存しており、ベラトリジンによる細胞内Na_+濃度の増加と相関していた。このことは、神経細胞の生存/細胞死制御に関しNa_+を介した機構が存在することを示唆している。
課題番号：08780693
膜脱分極による遅延性遺伝子発現機構
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 重点領域研究, 1996年 - 1996年
小池 達郎; 田中 秀逸, 北海道大学
配分額（総額）：2000000, 配分額（直接経費）：2000000
神経活動に伴う膜脱分極は、神経細胞の生存・機能維持及び形成されたシナプス結合回路の長期的な安定性をもたらすと予想される。ラット上頚神経節(SCG)の培養系についての膜脱分極下で発現の変化する遺伝子の探索、及びSCG細胞のNGF除去後の細胞死に関し膜脱分極によるNa+の流入に依存した神経細胞生存/死制御の機構の存在を明らかにした。
1)神経細胞の脱分極に伴い遅延性に発現する遺伝子の単離
SCG細胞を用いて高カリウム処理による脱分極に伴い遅延性に発現の変化する遺伝子をRAP-PCR法を用いて探索した。対照と比較したところ、25本のバンドに変化が見られた。それらのクローニングを行い、15本のバンドに関したcDNAを持つと思われる約50個のプラスミドを得た。脱分極に対する応答の再現性を確かめる為、プラスミドDNAをドットブロットしたメンブレンを準備し、レバースノーザンを行った。その結果、高カリウムによる脱分極処理で発現の増加する3種のクローン(RAP1-11,1-16,3-2)と発現の減少する3種のクローン(RAP1-2,2-9,4-24)について再現性が確かめられた。うち4本(RAP1-2,1-11,3-2,4-24)に付いてシークエンシング、ホモロジー検索を行ったところ、3本は未知で、1本(RAP1-11)は、登録はあるが機能の不明なヒト脳で発現する遺伝子クローン36066と高い相同性があった。
2)ベラトリジンによる脱分極に伴うナトリウム流入に依存した神経細胞の生存
ベラトリジンはNa+チャンネルの活性化剤である。1μM以下の濃度ではNa+の流入のみが観測された。更に低濃度のベラトリジン(0.25〜0.75μμM)は細胞死を遅延せることがわかった。この細胞死遅延効果は明らかに細胞外のNa+に依存しており、ベラトリジンによる細胞内Na+濃度の増加と相関していた。このことは、神経細胞の生存/細胞死制御に関しNa+を介した機構が存在することを示唆している。
課題番号：08271201
培養細胞モデル系によるニューロナルアポトーシスの分子機構
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 重点領域研究, 1996年 - 1996年
小池 達郎; 田中 秀逸, 北海道大学
配分額（総額）：1500000, 配分額（直接経費）：1500000
神経成長因子(NGF)存在下で交感神経様細胞に分化させたPC12細胞は、NGF除去に伴い細胞死を起こす。この細胞死に伴い、BiP/GRP78遺伝子の発現が増加することを見いだした。BiPは小胞体に存在するHSP70ファミリー蛋白質の1つで、シャペロン蛋白質として働きを持ち、合成された分泌性蛋白質の放出や小胞体-核シグナル伝達に重要な役割を担っている。神経細胞死制御における小胞体の関与を明らかにするために、このストレス蛋白質BiP/GRP78の発現を、中枢、及び末梢の神経初代培養系の細胞死において検討した。神経細胞死に伴うBiP/GRP78mRNAの増加は、ラットの小脳顆粒細胞の培養系でも確かめられた。生後7日のラット小脳から単離した顆粒細胞は、通常のカリウム濃度(5.4mM)下では、培養5日(DIV6)で変性を始め7日(DIV8)にはほぼ死滅する。BiP/GRP78発現増加のピークはDIV6の細胞から得られたRNAに対して確認され、DIV3の細胞の値の1.7〜2.2倍であった。一方、培養上頚神経節(SCG)細胞はNGF除去後、24時間には変性を初め、36時間には細胞体の萎縮・突起の崩壊を起こし、細胞死に至ることがわかっている。この細胞死に伴うBiP/GRP78の発現増加を調べたところ、mRNAレベルでは検出できなかったが、抗BiP抗体を用いた免疫組織化学的手法により、蛋白質レベルでの増加が確認された。細胞質のストレス蛋白質であるHSP70の発現量はmRNAでも蛋白質レベルでも細胞死の過程で変化しなかった。このことは、細胞死において、ストレス蛋白質のなかでBiP/GRP78の発現が、特異的に制御されることを示唆している。
課題番号：08256202
発生過程における神経細胞死の制御機構
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 一般研究(B), 1994年 - 1995年
小池 達郎; 田中 秀逸, 北海道大学
配分額（総額）：5700000, 配分額（直接経費）：5700000
(1)上頸神経節(SCG)細胞の神経細胞死と細胞内のCa2^+との相関
脱分極シグナルの発達に関して、種々の発生段階(E16-P7)のラットSCG細胞及びそれらをNGF処理した時間経過を関数として調べた。その結果、L型Ca2^+チャンネルの発達が最も重要であることが、細胞内Ca2^+濃度のfura-2標識による蛍光画像解析及びRT-PCR法によるL型Ca2^+チャンネル量の測定から判明した。更に、高K^+培地処理による細胞生存は細胞内Ca2^+濃度の上昇によるとすれば(Ca2^+セットポイント仮説)細胞死においては細胞内Ca2^+濃度の降下が起こるはずである。実際、細胞内Ca2^+濃度をBAPTA-AM等でキレートした時、細胞死が起こり、これは染色体の凝縮の前にc-fosの核への移行を伴い、タンパク質合成RNA合成を必要とする積極的な細胞死であった。
(2)小脳顆粒細胞の細胞死とその発達
生後8日目のラット小脳から顆粒細胞を分離し、培養すると7日目で細胞死が起こった。これが発生過程での細胞死に対する事を示した。それは、その細胞死がシクロヘキシミド、脱分極、BDNFで抑制されること更にアポトーシスであることを示した。又、trkBの存在もRT-PCR法及びanti-trkB抗体を用いたimmunoblotで確かめた。実際、小脳顆粒細胞は外顆粒層から内顆粒層に移動する際、trkBの発現が見られることが明らかになり、その後のシナプス形成で栄養因子依存性を獲得することに対応していると考えられた。
(3)プログラム細胞死過程で活性化するメッセージの同定
BAPTA-AM、Thapsigargin、calcium ionophoreなどで処理するとBiP/GRP78の免疫染色は増強した。神経栄養因子除去によるアポトーシス過程でもBiP/GRP78が著しく活性化した。このような相関は細胞死と細胞内カルシウム調節機構との関連を示唆する。
課題番号：06454686
過剰なNa^+流入による神経細死の機構
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 重点領域研究, 1994年 - 1994年
小池 達郎; 田中 秀逸, 北海道大学
配分額（総額）：2200000, 配分額（直接経費）：2200000
膜電位依存性Na^+チャンネルの活性化剤であるベラトリジンはNGF除去による上頸神経節細胞の細胞死を抑制することを見いだしたが、この効果はNa^+イオンの細胞への流入によるものであった。一方、Na^+イオンが過剰に流入すると神経細胞死を誘発し、その効果は神経細胞の成熟に伴って増強された。本報告では過剰なNa^+イオンの流入による神経細胞死の機構とその発達について詳細に調べた。上頸神経節細胞を、0.1-40μMベラトリジン(VERA)で10-15時間処理すると、用量依存的に毒性を示し、40μMでは約80%の細胞が死滅した。VERA作用の特異性が保たれる範囲即ち、テトロドトキシンで抑制抑制される範囲で実験する為、その濃度を10μM以下に抑えた。この濃度では蛍光イメージング法によると、細胞外のCa2^+もNa^+も流入するため、VERAの毒性がCa2^+の流入によるのかNa^+の流入によるのかを調べた。低Ca2^+濃度ではVERAの毒性は保たれているのに反し、低Na^+濃度ではその作用は完全に失われた。この為、毒性はNa^+の流入により、かつ適当な流入は細胞死を抑制することから、過剰に流入される為に起こると考えられる。過剰なNa^+イオンの流入による細胞死のメカニズムとしては細胞体だ縮むこと、ビスベンザミドで染色するとアポトーシスに特徴的な染色体の凝縮か起こることから、アポトーシスであろうと考えた。更に、細胞外液のK^+濃度が100mM以上では、VERA毒性は突起のみにとどまり、細胞体の収縮は起こらなかった。これらの結果から、過剰なNa^+流入がRVD(Regulatory Volume Decrease)を経て、上頸神経節細胞のアポトーシスを誘発したと推定した。この事実はグルタミン酸毒性などの作用を考える際に重要な情報となると思われる(投稿中)。
課題番号：06272225
神経栄養因子欠乏による神経細胞死の機序
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 重点領域研究, 1992年 - 1992年
小池 達郎; 田中 秀逸, 佐賀医科大学
配分額（総額）：2200000, 配分額（直接経費）：2200000
神経細胞は発生過程でその約50%の細胞が脱落する事が知られており、これを自然に起こる神経細胞死と呼んでいる。この神経細胞死は、標的細胞により分泌される神経栄養因子の限定的供給による競合過程の結果であると考える根拠が蓄積されている。特に最近種々の系においてこの細胞死が積極的な過程からなることが示唆され、プログラム神経細胞死として、そのカスケードの解明が重要な課題となっている。ラット新生児上頸神経節神経節細胞を1週間NGF存在化で培養した後、培地中に抗NGF抗体を加えNGFを除去すると、細胞死が起こり、死細胞の割合は2日後には80-90%に達すること、シクロヘキシミド(CHX)やアクチノマイシンD(ACD)により細胞死は阻止されることから最も良いモデルと考えられる。しかし、細胞内カスケードや細胞死関連蛋白質(DAP)を同定、単離するにはもっと多量に試料を調整出来るシステムが望ましい。我々はPC12細胞をNGF処理して分化させるとNGF除去に応答して細胞死が起こることを見いだした。この細胞死はACD、FGF、cAMP、高K+培地で抑えられるが、EGFやTPA等では抑えられないので、血清除去によるPC12細胞死とは異なり、transcription依存的であり、モデルとして有用と考えた。NGF除去により引き起こされる細胞内カスケードを調べる目的で、NGF除去後経時的に細胞を可溶化し、SDS-PAGEを行い、抗phosohotyrosine抗体を用いてWestern Blottingを行うと、p120,p90,p73,p53の主要なチロシンリン酸化蛋白質に脱リン酸化が起こることが判った。NGFを加えた時に顕著に活性化されることが知られているMAPKp44、p42活性は低く、このカスケードは関与していないと思われる。一方SDS-PAGE後の転写膜を用いてkinase活性をrenaturationする方法で自己リン酸化能を調べると、NGF除去に伴って主要なリン酸化活性(Ser/Thr)が徐々に減少することが判った。これらの脱リン酸化カスケードが直接細胞死を導くのか不明であるが、この脱リン酸化反応経過はCHXやACD処理で遅れることから、なんらかの制御された過程であると考えられる。
課題番号：04258216
神経細胞死・変性に伴って活性化されるカスケエードの解明
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 一般研究(C), 1991年 - 1992年
小池 達郎; 田中 秀逸, 佐賀医科大学
配分額（総額）：1700000, 配分額（直接経費）：1700000
1.神経栄養因子除去による神経細胞の細胞死に伴い活性化されるカスケードの同定
細胞死に関連した物質(DAPS)を同定するためには、現在の技術では多量に試料を調製する必要がある。この為、分化したPC12細胞及び小脳granule細胞を用いた。生後7日目のラット小脳から単離したgranule細胞は培養5日目には全て死に、この過程は蛋白質合成阻害等で抑えられるactiveな過程であった。又、脱分極すると細胞死は防げることが判った(3年度)。この栄養因子欠乏による細胞死における情報伝達系を調べる為、クローニングを行った。シクロヘキシミド-マイナス(細胞死の起こる)及びプラス(細胞は死なない)の条件下で細胞を培養し、それらの細胞から抽出したmRNAからcDNA Libraryをラムダベクターを用いて作成した(4年度)。更に両者のSubtracted Libraryを作成する試みを行っている。このSuBtractionが十分うまくいっているとはいいがたく、他の方法の模索も進めている。
2.NGF除去により引き起こされるカスケードの過程とその阻止機構の解析
ラット新生胎児の上頸神経節から得られた細胞とNGF処理したPC12細胞でNGF除去により引き起こされる細胞死は相同なカスケードを取ることが判った(3年度)。そこで、NGF除去後経時的に、PC12細胞を可溶化,SDS-PAGE,蛋白質の転写膜の作成を行い、抗phosphotyrosine抗体を用いてWestern Blotを行ったところ、4つの主要なチロシン燐酸化蛋白質に脱燐酸化が起こることが判った(4年度)。一方SDS-PAGE後の転写膜を用いてkinase活性をrenaturationし自己燐酸化能を調べたところ、NGF除去に伴い主要な燐酸化活性が徐々に減少していた。これらの脱燐酸化カスケードが直接細胞死を導くのか不明であるが、この反応過程はCHXやACD処理で遅れることから、なんらかの制御された過程であると思われる。又、この細胞死カスケードを阻止する機構として脱分極による選択的チロシン燐酸化を見いだしている(4年度)。この蛋白質の同定を分子生物学的手法で進めている。
課題番号：03833026
神経栄養因子欠乏による神経細胞死の機序
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 重点領域研究, 1991年 - 1991年
小池 達郎; 田中 秀逸, 佐賀医科大学
配分額（総額）：2000000, 配分額（直接経費）：2000000
(1)SCG及びPC12細胞の細胞死、変性における情報伝達機構の機序
ラット新生児上頸神経節神経節細胞を1週間NGF存在化で培養した後、培地中にNGF抗体を加え、NGFを除去すると、細胞死が起こる。死細胞の割合は、培地中に出てくるアデニル酸リン酸化酵素の活性から定量化した。この細胞死は細胞内カルシウムの上昇の他、cAMPの上昇によっても阻止された。即ち、細胞死はカフェイン等のメチルキサンチンによって阻止されたが、それはこの薬物による細胞内カルシウムの一過性の上昇によるのではなく、cAMPフォスフォジエステラ-ゼ阻害剤としての作用によっていた。これは同時に持続的な細胞内カルシウムの上昇が必要とするカルシウムセットポイント仮説を支持するものと考えた。シクロヘキシミド(CHX)により蛋白合成を抑えると細胞死は阻止されることが知られているが、CHX投与による実験から細胞死への最終的なコミットメントはNGFを除いて15時間後に起こった。カルシウムやcAMPはこのCHX感受性部位より下流の部位に作用することで細胞死を阻止することが判った。又PC12細胞をモデルとして使うことにより、神経突起の変性の機構を細胞体の変性とは別に追求することが可能になり、特にプロテア-ゼ阻害剤の効果を中心に調べた。又、NGF除去によりcーfos等のprotooncogeneの初期の遺伝子の発現を促進するかNorthern Blotにより調べた結果、発現を促進することが判った。その他、Cキナ-ゼ系の関与、リソゾ-ム系の関与はなかった。
(2)小脳granule神経細胞のin vitroでの細胞死
小脳granule細胞を7日目のラット小脳から調製した。この時点で細胞はまだ増殖している為、90%pureなgranule細胞を得られる利点がある。栄養因子説によれば、postmitoticな神経細胞はそのtarget細胞から栄養因子の補給をうけないと細胞死が起こる。実際、小脳granule細胞は培養6日目には全て死に、この細胞死は脱分極によって阻止される。この脱分極は細胞内カルシウムの上昇と相関していた。この細胞死はシクロヘキシミド又はコルジセピンにより蛋白RNA合成を抑えると細胞死は阻止されることから、交感神経節細胞の細胞死と共通の特徴を持つ。この系を中枢神経細胞の細胞死のモデルとして更にその機構に関する研究を続ける予定である。
課題番号：03263217
栄養因子欠如による神経細胞死の分子生物学的研究
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 一般研究(C), 1990年 - 1990年
小池 達郎; 田中 秀逸, 佐賀医科大学
配分額（総額）：1400000, 配分額（直接経費）：1400000
1.栄養因子除去によって引き起こされる初期カスケ-ド過程の同定
我々は神経細胞死のモデルとしてPC12細胞を選び,細胞死のおこる条件について調べた。その結果PC12細胞を神経成長因子(NGF)処理して充分分化させるとNGF除去による細胞死が起こることが示された。PC12細胞と交感神経節細胞ではその細胞死のタイムコ-ス,感受性等に差異があり興味ある知見がえられた。例えばPC12の場合の細胞死はFGFで抑えられたが,交感神経節では抑えられなかった。これは両者は組識特異性の差と考えられた。PC12を使うことは生化学実験を行う上で非常な利点があると考えられる。NGFを除いた時に起こるカスケ-ドの同定として,cーfosプロトオンコジンの消長をノ-ザンブロットにより調べた。その結果NGF除去後,30分〜1時間でピ-クとなりその後全く活性化は見られなかった。このタイムコ-スはナイ-ブなPC12細胞にNGFを投与した時にみられるcーfosの活性化とよく似ており,NGF投与と除去の両方にcーfosが関与していることが示され,細胞の応答機構のシンメトリ-という概念を提唱した。現在cーfos,cーjumのセンス及びアンチセンスオリゴRNAを合成し,細胞死の機構にcーfos活性化がどう関与しているかを調べている。
2.シクロヘキシミドに抑えられるカスケ-ド過程の同定
NGF除去によるPC12細胞の細胞死はシクロヘキシミドで部分的に抑えられることが判った。このことからシクロヘキシミド^<(CX)>の関与するステップを同定することを目的に±CXの条件下でmRNAを単離し,λ6EMベクタ-を使いライブラリ-を作成し,その差のライブラリ-を作ることにより,カスケ-ドの産物を同定しようと試みている。現在ようやくライブラリ-の作成にまで到達した。
課題番号：02807012
交感神経節細胞の神経成長因子依存性と細胞内カルシウム
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 重点領域研究, 1989年 - 1989年
小池 達郎; 田中 秀逸, 佐賀医科大学
配分額（総額）：1700000, 配分額（直接経費）：1700000
1脱分極による神経細胞死の阻止
交感神経節細胞はその生存に神経成長因子(N6F)を必要とする。即ちN6Fを除くとin vivoでもin vitroでも神経細胞は死んでしまう。ところが高K^+培地(35mM)又はコリン、カルバミルコリン等のニコチンアゴニストは共に脱分極をひきおこすことにより細胞死を阻止することを見出し、この材構を詳しく調べた。その結果高K^+効果はCa^<2+>除去倍地では失われること、Ca^<2+>チャネルアンタゴニスト(ニモジピン、ニフェディピン)で阻害され、アゴニスト(BayK6644等)で増強されることから、Ca^<2+>チャネルを介して細胞外Ca^<2+>の流入によると考えられた。一方ニコチニックアゴニストは細胞外Ca^<2+>を除いてもその効果は失われず、細胞内Ca^<2+>をキレ-ト剤により低下させるとその効果が失われることから細胞内Ca^<2+>の放出によると考えた。この結果から細胞内Ca^<2+>細胞内Cu^<2+>とN6F依存性に関して仮説を提出した。
2培養交感神経節細胞の細胞内カルシウム濃度の測定
上記仮説の正否を調べるべく、細胞をfura-2によりラベルし、細胞内Ca^<2+>濃度を画像解析法により測定した。その結果通常の条件下で交感神経細胞の細胞内Ca^<2+>は100nM前後であり、高K^+(35mM)による脱分極により200〜230nMに上昇することが判った。又細胞を培養していくと3-4週間で交感神経細胞のN6Fに対する依存性は変わっていく即ちAgingSC6はその生存がN6Fに依存しないが、その場合細胞内Ca^<2+>濃度は高い(200〜250nM)ことが明らかになった。これらの細胞をε6TA処理して細胞内Ca^<2+>濃度を低下させると、交感神経細胞は再びN6F依存性をとりもどした。この結果から上記仮説は支持されたと考えている。
課題番号：01641533
神経成長因子に対する応答性の調節機構ー受容体レベルの研究ー
日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 一般研究(C), 1987年 - 1988年
田中 秀逸; 小池 達郎; 高島 明彦; 小池 達郎, 佐賀医科大学
配分額（総額）：1900000, 配分額（直接経費）：1900000
1.PC12細胞での神経成長因子(NGF)受容体のモジュレーション
外液K^+濃度の増加に伴い、^<125>IーNGFの細胞表面への結合量・細胞内への取り込み量が共に増加した。高K^+処理と同じ効果は、ベラトリジン等の脱分極剤によっても引き起こされた。低いNGF量(0.01〜1ng/ml)を投与したPC12細胞に限り、高K^+培地中で突起形成能が増強した。これらの結果は、高K^+処理が細胞の接着を高めると共に、細胞へのNGF結合量を高めることによると考えられた。カテコールアミンによっても細胞への^<125>I-NGF結合量は変化した。
2.神経伝達物質放出の調節機構
PC12細胞のドーパミン放出を高める高K^+処理の効果は、ホルボールエステル(TPA)による前処理でさらに増強された。高K^+処理による細胞内Ca^<2+>濃度の増加はTPA処理により弱められた。TPA処理による高K^+下のドーパミン放出量の増加は、ニカルディピン、Cd^<2+>、Co^<2+>で阻害、ベラパミルで部分的に阻害された。これらは、プロティンカイネースCが、高K^+に応答した細胞のドーパミン放出をニカルディピン感受性Ca^<2+>チャンネルの修飾により調節している可能性を示している。
3.NGFとNGF受容体との相互作用へのGTP結合蛋白質の関与
細胞膜への^<35>S-GTPγSの結合が、細胞を前もってNGF処理することにより高められた。種々のヌクレオチドをパルス電圧法を用いて細胞内に導入した後、PC12細胞への^<125>I-NGF結合量の変化を調べた。その結果、GTPγS及びGTPを導入した際、明らかに^<125>I-NGF結合量が増加した。GTP、GTPγSを導入した細胞では、短時間のNGF処理による突起形成が増強された。これらは、NGFとNGF受容体との結合の過程にGTPを必要とする系が存在することを示唆している。
課題番号：62540552
アカパンカビの遺伝学的研究－DNA損傷後のDNA修復と細胞死との選択制御－
競争的資金
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